网站建设上机考试,大型网站建设历史,音乐app界面设计,汕头seo摘要 尽管mRNA疫苗已用于COVID-19的预防#xff0c;但仍然面临不稳定和易降解的风险#xff0c;这是mRNA疫苗存储、配送、效价等面临的重要障碍。先前的研究已表明#xff0c;增加二级结构可延长mRNA的半衰期#xff0c;再加上选择优化的密码子#xff0c;可改善蛋白表达。… 摘要 尽管mRNA疫苗已用于COVID-19的预防但仍然面临不稳定和易降解的风险这是mRNA疫苗存储、配送、效价等面临的重要障碍。先前的研究已表明增加二级结构可延长mRNA的半衰期再加上选择优化的密码子可改善蛋白表达。因此原则上mRNA的设计算法必须优化二级结构稳定性和密码子的使用。然而由于同义密码子的存在使得mRNA设计的工作量非常庞大例如靶向SARS-CoV-2 Spike蛋白的mRNA就有~10^632种方案这就带来了难以克服的计算挑战。利用计算语言中类似的概念我们提供了一种简单且意想不到的解决办法寻找最佳的mRNA序列类似于在发音相似的备选句子中识别最可能的句子。利用我们的算法LinearDesign设计Spike蛋白的mRNA仅需11分钟并且同时优化稳定性和密码子的使用。在针对COVID-19 和 水痘带状疱疹病毒varicella-zoster virusmRNA疫苗与密码子优化的基准算法相比LinearDesign大幅度提高了mRNA的半衰期和蛋白的表达显著增加了抗体的滴度体内实验中增加了128倍。该结果揭示了mRNA设计算法还有很大的改进空间促进了对原本触不可及的高效且稳定的mRNA设计的探索。我们的工作为mRNA疫苗乃至mRNA药物如单克隆抗体和抗癌药物的研发带来了“及时雨”timely tool。 正文 mRNA疫苗因其可批量生产、安全性和有效性而被认为是预防包括COVID-19在内的可行方法。然而mRNA分子在化学上不稳定且容易降解导致蛋白质表达不足进而降低免疫原性和成药性。这种不稳定性也成为疫苗储存和分发中的主要障碍mRNA疫苗需要使用冷链这也就限制了其在发展中国家的使用。因此人们迫切希望获得一种具有增强稳定性的mRNA分子可能会具有更高的效力和良好的临床疗效。 虽然化学稳定性很难建模但之前的研究已经确定了它与次级结构的相关性这通过热力学折叠稳定性进行量化改善这种结构稳定性结合最佳密码子使用可以增加蛋白质表达。因此一个合理的mRNA设计算法必须优化两个因素即结构稳定性和密码子使用以增强蛋白质表达。 然而由于搜索空间search space呈指数级增长mRNA仅考虑编码区设计问题非常具有挑战性。每个氨基酸由一个三联密码子编码即三个相邻的核苷酸但由于遗传密码的冗余性20个氨基酸对应64个密码子大多数氨基酸具有多个密码子。这种组合导致候选序列数量极大难以处理。例如SARS-CoV-2的刺突蛋白Spike protein由1,273个氨基酸组成可以由约2.4×10^632个mRNA序列编码图1a。这带来了无法逾越的计算挑战并排除了枚举的可能性因为对于刺突蛋白来说枚举需要花费10617亿年的时间图1b。另一方面传统的mRNA设计方法密码子优化11, 12仅优化密码子使用但几乎不会改善稳定性忽略了高稳定性mRNA存在的巨大空间。优化GC含量具有类似的效果因为它与脊椎动物中的密码子使用相关13。因此大多数高稳定性mRNA的设计仍然是未知的。 在这里我们提供了一个简单的算法LinearDesign通过意外地将这个具有挑战性的问题归约为计算语言学中经典概念“格子解析”6图1c来解决。我们展示了在众多类似的备选方案中找到最佳mRNA类似于在众多类似声音的备选句子中找到最有可能的句子。更具体地说我们使用确定有限状态自动机deterministic finite-state Automaton, DFA来构建mRNA设计空间类似于“词格word lattice”6它紧凑地编码了指数级的候选mRNA。然后我们使用格子解析来找到DFA中最稳定的mRNA或在加权DFA中找到稳定性和密码子最优性之间的最佳平衡。这种结合自然语言的方法使得我们开发了一个高效的算法可以将计算量控制在mRNA序列长度的平方级。从这个意义上说我们的工作将庞大的搜索空间转变为一种福音设计自由而不是一个障碍。 图1 与密码子优化基准相比我们设计的COVID-19和水痘带状疱疹病毒VZVmRNA疫苗在体外化学稳定性、细胞内蛋白质表达和体内免疫原性方面均有显著改善。特别是COVID-19疫苗相比基准benchmark能够实现高达128倍的抗体反应。这一令人惊讶的结果揭示了mRNA设计的巨大潜力并使得这些先前难以实现但高度稳定且高效的设计得以被探索。因为LinearDesign可以优化编码所有治疗蛋白质的mRNA包括单克隆抗体7和抗癌药物8的mRNA因此我们的工作不仅为mRNA疫苗提供了及时和有前景的工具也为已经显示出具有改变医疗保健的巨大潜力的mRNA治疗提供了工具14。 构想与算法 先前的工作5为mRNA设计建立了两个主要目标即稳定性和密码子最优性这两者协同作用以增加蛋白质表达。为了优化稳定性在给定蛋白质序列的情况下我们的目标是找到在所有可能编码该蛋白质的mRNA序列中具有最低最小自由能变化MFE的mRNA序列。换句话说对于每个候选mRNA序列我们使用标准的RNA折叠能量模型15, 16筛选MFE能量最低的mRNA序列。因此这是双重最小化的问题扩展数据图1a。然而利用这种朴素的方法将花费数十亿年的时间因此我们需要一种高效的算法而不是枚举法。 扩展数据图1 接下来我们旨在共同优化mRNA的稳定性和密码子最优性。后者通常通过密码子适应性指数Codon Adaptation Index, CAI17来衡量CAI被定义为mRNA中每个密码子相对适应性的几何平均值。由于CAI的取值范围在0和1之间但MFE通常与mRNA序列长度成正比我们将CAI的对数乘以mRNA中的密码子数并使用一个超参数lambda来平衡MFE和CAIlambda 0表示仅考虑MFE。综合目标函数为MFE - lambda|p| log CAI 其中|p|表示蛋白质的长度。有关详细信息请参阅方法 §1.1 和扩展数据图1b。 接下来我们使用从自然语言中借鉴的两个概念来描述解决这两个优化问题的方法确定有限状态自动机DFA格子和格子解析。 设计空间表示DFA格子受计算语言学中对歧义的“词格”表示扩展数据图2a启发我们使用类似的格子或更正式地说确定有限状态自动机DFA来表示每个氨基酸的密码子选择图2a和扩展数据图1c有关正式定义请参阅方法 §1.2。在为蛋白质序列中的每个氨基酸构建一个密码子DFA后我们将它们连接成一个单一的mRNA DFA在起始状态和终止状态之间的每条路径代表一个可能的编码该蛋白质的mRNA序列图2b和扩展数据图1d。 图2 扩展数据图2 目标1稳定性格子解析 已知RNA折叠等同于自然语言解析其中随机上下文无关语法SCFG可以表示折叠能量模型18扩展数据图1e-f。但是对于mRNA设计来说难点在于如何将所有的mRNA序列一起在DFA中进行折叠我们借鉴了“格子解析”19, 6的思想该方法将单个序列解析推广到同时处理格子中的所有句子以找到最有可能的句子图1c和扩展数据图2。类似地我们使用格子解析同时折叠mRNA DFA中的所有序列以找到最稳定的序列图2b和扩展数据图1g-h。值得注意的是格子解析也是动态规划的一种实例但搜索空间更大而单个序列的折叠可以看作是一个单链DFA的格子解析特例。这个过程也可以解释为SCFG-DFA的交集扩展数据图1a其中SCFG用于稳定性评分而DFA则划定了候选集。该算法的运行时间与mRNA序列的长度呈立方关系方法 §1.3但在实际应用中两者仅呈二次方关系图3a。 图3 目标2密码子最优性带权重的格子解析 我们将确定有限状态自动机DFA扩展为带权重的确定有限状态自动机WDFAs以便在边权重中集成密码子最优性。由于我们的联合优化公式将CAI因子分解为每个密码子c的相对适应性w(c)我们在每个密码子DFA中设置边权重使得密码子c的路径成本为-log w(c)这可以解释为与最优密码子的“偏差量”。然后在带权重的mRNA DFA中每条起始-终止路径的成本是对应mRNA中每个密码子c的-log w(c)的总和这与其-log CAI成正比图2d。现在格子解析同时使用随机语法用于稳定性和带权重的DFA用于密码子使用并解决具有优化保证的联合优化问题可以将其视为SCFG和WDFA之间的加权交集20扩展数据图1b方法 §1.4。 DFA的表现能力 我们的DFA框架非常通用可以表示替代的遗传密码、修饰核苷酸和编码约束因素。详细信息请参见方法 §1.7扩展数据图3和补充图5。 扩展数据图3 线性时间近似法 对于长序列精确的设计算法可能仍然很慢。此外由于mRNA设计中涉及许多除稳定性和密码子使用之外的因素次优设计可能也值得在湿实验中进行探索。因此受先前工作LinearFold21的启发我们开发了一种近似搜索版本使用波束搜索在线性时间内运行每一步只保留最有前景的b个项目b是波束大小。 相关工作 之前的两项研究也通过动态规划解决了“最稳定的mRNA设计”问题我们的目标1但是利用Zuker算法的专门扩展22, 23无法兼具密码子最优性目标2。相比之下我们建立了mRNA设计与计算语言学中的格子解析之间的联系这也是我们工作最具创新性的贡献。这种联系使得我们能够使用更简单、更通用的算法可以同时优化密码子使用并利用一个新颖的目标函数将CAI因子分解到个别密码子上。我们还通过体内验证了这些算法设计的mRNA结果显示两个mRNA疫苗的效果具有显著的改善图4-5。详细信息请参见方法 §1.1和§1.8。 图4 计算机模拟结果和分析 图3a展示了LinearDesign对UniProt蛋白质的运行时间。LinearDesign通过两个优化目标的组合进行展示即仅MFE目标1与MFECAI目标1和2以及两种搜索模式即精确搜索与波束搜索波束大小b500。经验证由于DFA表示和格子解析的便利性LinearDesign在实际应用中对mRNA序列长度n呈二次方扩展n10,000 nt补充图7-8。接下来我们集成CAI的精确搜索CAI权重lambda4具有相同的实证复杂性与仅MFE版本相比仅慢约15%这要归功于我们的DFA表示对于添加CAI的便利性。最后我们的波束搜索版本b500进一步加快了设计速度并且与序列长度呈线性扩展仅MFE的近似搜索在SARS-CoV-2 Spike蛋白上仅需2.7分钟而精确搜索需要10.7分钟近似误差即能量差异%定义为1 - MFEapprox_design / MFEexact_design仅为1.2%。实际上随着序列变得更长这个百分比趋于稳定表明波束搜索质量不会随着序列长度的增加而下降补充图9。 对于偏好GC的密码子的mRNA例如人类传统的密码子优化方法确实可以提高稳定性但仅略有改善图3b-c因为其优化方向粉色箭头在很大程度上与稳定性优化方向蓝色箭头几乎正交。相比之下我们的LinearDesign可以直接优化稳定性并找到最稳定的mRNA序列。在COVID Spike蛋白和VZV gE蛋白中最低的MFE值l0比最优CAIl¥的MFE值低1.8倍。此外我们的最稳定设计主要具有双链二级结构图3d据预测这种结构更不容易降解5。通过l在0到¥范围内变化LinearDesign计算了mRNA设计空间的可行性界限最优边界图3b-c中的蓝色曲线请参见扩展数据图4中–¥, 0]中的l。此外当密码子偏好偏向AU富集密码子如酵母时密码子优化实际上会导致稳定性的降低。 COVID-19 mRNA疫苗的结果 对于COVID-19 Spike蛋白质本研究使用了八条mRNA序列。其中七条序列序列A-G是使用LinearDesign算法设计的次优分子使用波束搜索(21, 25)。它们广泛分布在低MFE设计空间中图4a中MFE £ 1,400 kcal/mol的区域这是传统密码子优化算法无法达到的。为了更好地理解MFE和CAI参数的生物学影响我们设计了这些mRNA序列使它们在MFEB-C // D-E-F或CAIA-C-F // B-E // D-G-H方面几乎具有相同的值。第八个mRNA序列序列H是使用广泛使用的密码子优化算法OptimumGene™设计的基准序列。这个基准序列H已经被用于一种COVID-19 mRNA疫苗在两个动物模型中显示出高免疫原性并进入了中国的I期临床试验与中国疾控中心共同开发中国临床试验注册CTR20210542。所有的mRNA编码了完整的SARS-CoV-2野生型Spike蛋白的相同氨基酸序列并共享相同的5-和3-UTR有关序列请参见补充信息。 考虑到由结构化的5-leader区域可能对翻译效率产生负面影响5在运行LinearDesign时我们在设计中不包含前5个氨基酸而是使用一种启发式方法选择了前15个核苷酸。另外长的螺旋结构可能引起不必要的先天免疫反应27因此我们在设计中避免了这些结构。这也解释了为什么我们没有研究最低MFE的候选者最接近最优边界-图4中的蓝色曲线这些候选者通常包含较长的结构。详见方法§1.10。 除了编码区设计UTR结构对于翻译也至关重要28UTR工程对蛋白质表达具有深远影响3。尽管LinearDesign本身并不涉及UTR优化但它具有一个有趣的特性即其设计的mRNA分子相对于密码子优化的分子来说更具结构性与广泛使用的UTR结构形成较少的碱基配对从而对UTR的结构干扰较小扩展数据表1。这个推测在我们设计的不同UTR的VZV mRNA疫苗的实验中得到了验证LinearDesign设计的mRNA具有更高的蛋白表达水平和免疫反应。这些证据表明LinearDesign设计的有效性不依赖与UTR的选择这与近期的一项研究结果一致体内实验表明利用LinearDesign设计的三个具有不同UTR的mRNA的蛋白表达强度优于基准算法设计的mRNA见参考文献的图4a详见方法§1.8。 溶液中的结构紧凑性和化学稳定性 随后我们研究了mRNA分子的结构紧凑性被假设与折叠自由能变化相关。具有较低MFE的mRNA分子倾向于包含更多的二级结构呈现更紧凑的形状和较小的流体动力学尺寸。因此它在电泳中移动得更快。我们将mRNA样品加载到非变性琼脂糖凝胶上并发现RNA的迁移速率与序列A-H的MFE具有良好的相关性图4b尽管序列A-H具有相似的分子量。具有最低MFE的序列A移动最快其次是其他序列中具有最低MFE的序列顺序与它们的MFE值相符。具有最高MFE值的序列H移动最慢。这组数据证明了LinearDesign执行的MFE计算的有效性。 为了评估mRNA的化学稳定性我们将mRNA加入含有10 mM图4c或20 mM扩展数据图5Mg2的缓冲液中37°C孵育并在孵育后评估RNA的完整性类似于先前的研究29。序列A-H表现出明显不同的降解速率且与它们的MFE值具有良好的相关性图4c和扩展数据图5。具有最低MFE的序列A显示出最慢的降解速率其半衰期T1/2分别为10 mM和20 mM Mg2缓冲液中的20.0小时和12.6小时图4c和扩展数据图5。相比之下具有最高MFE值的序列H降解最快其T1/2分别为10 mM和20 mM Mg2缓冲液中的3.9小时和3.3小时。这些结果支持低MFE设计更能抵抗在溶液中的降解具有有利的生物学意义。 扩展数据图5 细胞内蛋白质表达 对于疫苗产品来说充分的抗原表达是引发有效免疫反应的关键因素之一。接下来我们评估了设计的mRNA的蛋白质表达情况。将所有序列A-H转染HEK293细胞后可以有效地将它们翻译成S蛋白。值得注意的是所有7个由LinearDesign生成的mRNA序列A-G的蛋白质表达水平均比基准序列H显著升高图4d和补充图12。具有与H几乎相同的CAI值但更低MFE的D和G序列的蛋白质表达量比H序列高2.3倍而具有最低MFE的A序列的表达量则提高了2.9倍。总的来说我们的结果与Mauger等人的研究结果一致即低MFE和高CAI能够协同提高蛋白质表达水平但我们能够使用具有比他们更低MFE的mRNA分子来测试这个假设这要归功于LinearDesign能够探索以前无法到达的设计空间。 体内免疫原性 我们进一步测试了这些设计是否能够在体内赋予优越的免疫原性。通过脂质基载体将序列A-H的mRNA递送至体内并对细胞免疫和体液免疫反应进行了评估。对于每个mRNA序列我们在C57BL/6小鼠肌肉均注射两剂疫苗间隔2周。评估了抗Spike IgG抗体水平、中和抗体NAbs水平以及Spike特异性干扰素-γIFN-γ分泌T细胞。LinearDesign生成的所有mRNA分子都能够引发强烈的抗体反应。相比之下序列H的mRNA几乎无法诱导抗体图4e-f。在抗原特异性T细胞反应上也观察到了类似的结果只有LinearDesign生成的mRNA能够引发强烈的Th1型T细胞反应图4g。离最优边界更近序列A-D图4a中阴影区域与基准序列H相比其抗Spike IgG抗体滴度增加了57~128倍中和抗体的滴度提高了9~20倍。 由于辉瑞/BioNTech的BNT162b2是最广泛采用的COVID-19 mRNA疫苗我们节选了它的mRNA序列作为并行对照。为具有可比性我们建立了新的mRNA分子BNT其5’和3’UTR序列与序列A-H保持一致蛋白编码序列采用BNT162b2的蛋白编码序列。BNT162b2的“2P”氨基酸突变31被恢复成野生型。该研究的4条序列A,C,H和BNT中与BNT mRNA相比序列A和C的降解速率显著降低扩展数据图6。值得注意的是,BNT和序列H具有非常相近的MFE和CAI图4a且具备相似的半衰期。此外与BNT和序列H相比序列A和C能诱导产生更高水平的抗Spike IgG抗体和中和抗体扩展数据图7。总之这些数据足以支持我们推断LinearDesign优化的mRNA分子在体外更稳定进而提高蛋白质的表达增强免疫原性。 扩展数据图6 扩展数据图7 VZV mRNA疫苗的结果 为了进一步评估LinearDesign的普适性我们还将该算法应用于水痘-带状疱疹病毒VZVmRNA疫苗的设计。VZV疫苗被认为是降低带状疱疹风险的有效方法32。使用与Spike mRNA设计相同的策略图4a我们生成了五个编码完整VZV gE蛋白的mRNA序列gE A-E。它们广泛分布在之前未被探索的高热稳定性区域图5a。这些序列与使用密码子优化工具GeneOptimizerThermoFisher Scientific开发33设计的gE-Ther序列进行了基准对比。所有这些mRNA包括野生型mRNAgE-WT共享相同的编码氨基酸序列和5/3 UTRs。有关序列的详细信息请参阅补充信息。与Spike mRNA数据一致图4b具有最低MFE的gE-A mRNA在非变性凝胶中显示出更高的迁移率图5b在10 mM Mg2缓冲液中T1/2为66.5小时图5c和在20 mM Mg2缓冲液中为50.7小时扩展数据图8a具有显著较慢的降解速率这表明与分子的紧凑性与化学稳定性正相关。相比之下gE-Ther在10 mM和20 mM Mg2缓冲液中的T1/2分别为10.9小时和5.9小时。我们还注意到由于长度较短34gE mRNA分子的稳定性总体上优于Spike mRNA。此外转染HEK293细胞后的48小时图5d和24小时扩展数据图8b大多数由LinearDesign生成的分子gE B-E在蛋白质表达方面表现优于gE-Ther和WT。但有趣的是表现最佳的mRNA分子是gE B-D它们在蛋白质表达方面表现优于具有最低CAI的gE-A和具有最低MFE的gE-E。这一发现再次强调了同时优化CAI和MFE的重要性。最优分子是那些具有有利的CAI和MFE值的分子在图5a中我们用浅蓝色阴影区域突出显示了这个“甜点”区域。最后我们在C57BL/6小鼠中评估了VZV mRNA的免疫原性。LinearDesign设计的mRNA分子gE-B, C 和E诱导产生抗gE IgG抗体的水平显著高于gE-Ther和WT图5e。 图5 扩展数据图8 讨论 有效的mRNA设计策略对于开发mRNA疫苗至关重要这些疫苗在当前和未来的流行病中展现出巨大的潜力。然而由于搜索空间巨大这是一个极具挑战性的问题。我们提出了一个简单的解决方案将mRNA设计问题简化为计算语言学中的经典格子解析问题。这种高度出乎意料的类比是这项工作最具创新性的部分它产生了一个高效的算法仅需11分钟即可处理SARS-CoV-2蛋白质的设计。该算法还可以同时优化稳定性和密码子使用这是根据文献和我们的VZV实验中对mRNA设计的重要性所确定的。我们的跨学科方法是近来语言学和生物学之间富有成果的交流之一35, 36。本研究全面评估了LinearDesign生成的mRNA序列并证明其在化学稳定性、蛋白质翻译和体内免疫原性等对疫苗性能至关重要的三个方面上优于常用的密码子优化基准算法。特别是我们针对Spike蛋白的设计在结合抗原上比密码子优化基准显示出高达128倍的抗体水平增加我们的VZV mRNA设计使用不同的UTR组合也显示出显著的改进。这些结果表明了LinearDesign在不依赖于UTR组合的优化编码区域方面的稳健性。事实上这两个方向编码区域设计和UTR工程3是互补的可以在未来的工作中结合起来。值得注意的是尽管我们设计的mRNA没有使用化学修饰这种修饰被广泛认为是mRNA疫苗最近成功的关键因素37,38,10,1,2仍然表现出高水平的稳定性、翻译效率和免疫原性且具有较低的生产成本。另一方面我们的算法与化学修饰相辅相成一旦相应的能量模型可用它可以轻松地适应并享受修饰核苷酸的好处。我们的工作仅考虑了稳定性和密码子使用但格子表示具有通用性一旦相关参数可用也可以适应于优化与mRNA设计相关的其他参数。通过释放以前无法触及的高稳定性和高效序列区域LinearDesign成为了应对当前和未来大流行病的mRNA疫苗开发的及时且有前景的工具。但更重要的是,这也是mRNA治疗领域分子设计的一般和原理性方法不仅适用于设计mRNA疫苗也可以广泛应用于mRNA治疗领域其他分子的设计。我们可以利用此方法设计编码各种治疗性蛋白质的mRNA如单克隆抗体、细胞因子、酶等用于治疗疾病。这为开发针对癌症、自身免疫性疾病等的mRNA治疗方法提供了很好的思路。 编者总结 研究人员开发了一种用于优化mRNA的设计算法该算法可以提高mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性。利用这种算法设计的mRNA可以产生更高水平和更持久的基因表达并诱导更强的免疫应答。 这项工作为mRNA在分子设计和医学中的广泛应用奠定了基础。它不仅对当前的新冠疫情有重要意义也为开发针对其他疾病的mRNA治疗方法提供了很好的参考。这种通用方法使我们可以设计各种具有治疗潜力的mRNA分子来调节人体的生物过程。 阅读原文信息 https://www.nature.com/articles/s41586-023-06127-z 往期精品(点击图片直达文字对应教程) 机器学习
