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原始生殖细胞Primordial germ cellPGC是生殖细胞前体可以产生卵母细胞和精子确保生命延续。尽管PGC特化PGC specification得到广泛研究但PGC种群在出生前迁移到胚胎性腺后如何维持和扩大仍然难以捉摸。转录因子如PRDM1/BLIMP1、PRDM14和TFAP2C和信号分子如BMP和WNT在PGC特化中发挥着至关重要的作用。核呼吸因子1Nuclear respiratory factor 1NRF1是一种已知参与线粒体生物发生的转录因子。最近研究表明在精子发生过程中NRF1与生殖细胞特异性基因CpG富集的低甲基化启动子区结合并直接激活其转录。目前研究揭示与周围的体细胞相比胚胎期迁移后的PGC中NRF1高表达可能是由于PGC基因组逐渐低甲基化。此外NRF1是PGC体外和体内增殖和存活所必需的且当异位表达时NRF1积极促进PSC分化。
2023年8月4日华东师范大学生命科学学院研究生王鹏翔等为第一作者在《Cell Proliferation》杂志发表题为“NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival”的研究论文该研究以原始生殖细胞PGC为研究对象通过RNA-seq和ChIP-seq等实验表明NRF1通过调控支持PGC编程的广泛转录网络和线粒体代谢参与调控迁移后PGC存活和增殖。本研究为PGC发育背后的功能机制提供了新的线索并验证NRF1是此过程中以前未被鉴定的调控因子。 标题NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survivalNRF1促进原始生殖细胞的发育、增殖和存活
时间2023-08-04
期刊Cell Proliferation
影响因子IF 8.5
技术平台ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等 研究摘要
NRF1是一种已知的线粒体代谢调控因子在PGC迁移后发育中起着关键作用。本研究结果表明在胚胎发育过程中NRF1蛋白水平在PGC迁移后逐渐升高。胚胎生殖细胞的特异性Nrf1敲除导致PGC增殖和存活受损。此外NRF1还可以主动促进多能干细胞的PGC分化。通过全转录组分析和ChIP-seq分析进一步发现NRF1直接调控PGC形成中的关键信号分子、增殖和细胞周期中的转录因子以及线粒体代谢中的酶。总的来说本研究结果强调了NRF1调控广泛转录网络以支持体外和体内迁移后PGC发育。 研究结果
1生殖细胞中特异性Nrf1敲除破坏迁移后PGC发育 图1NRF1为原始生殖细胞PGC发育所必需。
A 用NRF1和OCT4抗体在E9.5小鼠胚胎上通过免疫组织荧光IHF检测PGCs中NRF1表达。
B 用NRF1抗体和生殖细胞特异性蛋白DDX4抗体对E11.5–15.5胚胎性腺进行IHF测定。A-B比例尺50 μm。插入显示了代表性区域放大图像。
C-D 通过PGCs中的Tnap-Cre对野生型对照胚胎和Nrf1特异性敲除胚胎Nrf1−/f-Cre的E11.5–13.5性腺进行IHF测定抗Nrf1和OCT4抗体C抗Nrf1和DDX4抗体D用细胞核染料DAPI复染。比例尺15 μm。C白色箭头表示NRF1表达完全消失的OCT4 PGC。 2PGCs中Nrf1缺失导致雄性和雌性小鼠不孕 图2Nrf1基因敲除导致雄性和雌性小鼠不孕。
A Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠在P0和7周龄的睾丸形态。
B Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠在8周龄时睾丸和附睾的组织学研究。
C Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠7周龄的卵巢形态比较。
D Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠7周龄的卵巢切片组织学研究。黑色箭头和数字表示卵泡的不同发育时期。1原代卵泡2次生卵泡3黄体。 3NRF1缺失破坏了迁移后PGCs的存活和增殖 图3NRF1是迁移后原始生殖细胞PGCs增殖和存活所必需的。
A 用p20-GFP或p20-Cre-p2a-GFP诱导分化的Nrf1f/f PSC的流式细胞术分析。通过SSEA1染色检测GFPPGC样细胞PGCLCs右侧显示GFP/SSEA1PGCLC百分比。
B 使用BV421标记的抗Ki67抗体通过流式细胞术分析A的GFP/SSEA1PGCLC。
C 将A的GFP/SSEA1PGCLC与BV421标记的膜联蛋白V和碘化丙啶PI共染色然后通过流式细胞术分析样品。A–C数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。***p0.001.
D-E E11.5时Nrf1−/f-Cre胚胎及其野生型同窝同伴小鼠生殖嵴上的免疫组织荧光IHF使用抗OCT4和Ki67的抗体D或OCT4和裂解的Caspase 3CASP3抗体E。白色箭头表示Nrf1−/f-Cre胚胎中的OCT4/Ki67非增殖PGCsD或OCT4/Caspase3凋亡PGCsE。比例尺10 μm。 4NRF1过表达促进PSC PGCLC形成 图4NRF1促进PSC形成PGC样细胞PGCLC。
A 通过real-time RT-PCR检测BVPGCLC中Nrf1和原始生殖细胞PGC标记基因的相对mRNA水平与从BVSC PSC分化的BV−体细胞进行比较。
B 与对照组Ctrl相比内源性Nrf1激活Nrf1a时通过流式细胞术检测BVPGCLC。
C 内源性Nrf1激活后通过real-time RT-PCR检测第6天EB的相对mRNA水平。A–C数据以两次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。
D BVSC PSCs分化第5天的流式细胞术分析。在PSC分化的第2-5天通过DOX处理诱导NRF1表达p20-NRF1。使用相同DOX处理的空载体作为对照p20。左图为流式细胞术的代表性结果中间panel为BVPGCLC百分比。右图为BVSC PSC分化第5天EB的代表性图像。
E real-time RT-PCR检测第5天分化的EBs中Nrf1和PGC标记基因的mRNA水平。在PSC分化的第2-5天通过DOX处理诱导NRF1表达。D–F数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。A-F*p0.05**p0.01.***p0.001。N.S.无显著性。 5NRF1是直接调控PGC形成、线粒体代谢和细胞增殖的关键基因 图5NRF1调控转录网络诱导PSCs分化为PGC样细胞PGCLC
A RNA-seq分析中差异表达基因的Venn图Log2倍数变化0.58p0.05。
B 有或无NRF1过表达OE的BVPGCLC的RNA-seq分析检测到的基因火山图。
C 有或无NRF1-OE的BVPGCLC差异表达基因的GO分析Log2倍数变化0.58p0.05。D 对DOX诱导的NRF1-OEp20-NRF1或空载体对照p20的BVPGCLC的real-time RT-PCR分析。数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。*: p 0.05;**: p 0.01。***: p 0.001。 图6原始生殖细胞PGCsNRF1介导的转录网络特征。
A 从BVPGC样细胞PGCLCs中进行的ChIP-seq分析中获得的NRF1结合motif。
B 从ChIP-seq分析中获得的基因组区域NRF1结合位点分布。
C BVPGCLC中NRF1结合的靶基因的GO分析。
D ChIP-seq分析的基因组区域中NRF1靶基因启动子区域的代表性peaks。
E 用NRF1抗体或IgG对照对BVPGCLC的免疫沉淀的基因组DNA进行实时PCR分析。数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。*p0.05**p0.01.***p0.001。 关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共沉淀Chromatin Immunoprecipitation,ChIP是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定为研究的深入开展打下基础。
DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段并进行纯化和文库构建然后进行高通量测序通过将获得的数据与参考基因组精确比对研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系也可对多个样品进行差异比较。
应用方向
ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位
转录因子和辅因子结合作用复制因子和 DNA 修复蛋白组蛋白修饰和变异组蛋白
技术优势
物种范围广细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验微量建库只需5ng以上免疫沉淀后的DNA即可展开测序分析方案灵活根据不同的项目需求选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。
技术路线 易基因提供全面的DNA与蛋白互作测序方案详询易基因0755-28317900。 参考文献
Wang P, Su J, Wang J, Xie Y, Chen W, Zhong J, Wang Y. NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival. Cell Prolif. 2023 Aug 4:e13533. 相关阅读
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