网站建设活动策划方案,wordpress目录分类与菜单,手机域名怎么设置,企业网站 需求书接上文组学知识速递#xff08;五#xff09;|ChIP-seq知多少#xff1f;#xff0c;当我们实验完成#xff0c;拿到下机数据之后#xff0c;我们最关心的就是#xff0c;这个数据能不能用#xff1f;所谓数据能不能用#xff0c;其实我们会重点关注以下问题#x…书接上文组学知识速递五|ChIP-seq知多少当我们实验完成拿到下机数据之后我们最关心的就是这个数据能不能用所谓数据能不能用其实我们会重点关注以下问题
1fastq的测序质量过不过关
2实验本身有没有问题处理组与对照组是否有区别
3分析结果是否能挖掘出有用或者新的信息
接下来一起来找寻答案吧
Q1 ChIP-seq的分析一般有哪些步骤呢
ChIP-Seq即染色质免疫共沉淀-高通量测序是指通过染色质免
1FastQC用于简单的质量控制quality controlFastQ_Screen用于检查测序数据有无污染
2经过质控的reads通过bowtie2与参考基因组比对
3ChIP-seq peaks则用MACS2进行分析
4这些peaks则通过ChIPseeker进行注释motif预测则使用HOMER
5最后Peak差异则使用MAnrom1。
Q2 有效数据量达到多少比较合适
一般情况下分析得到差异显著的峰的个数随着reads数目的增加而以稳定的比例增加图中实线所示这种情况下reads的数目没有饱和。但是当对Chip样品和Input DNA样品的峰之间的差异定义一个最小的富集阈值后分析得到的新峰的比率逐渐减小图中虚线所示这时当分析足够具有显著差异peaks数目的时候结合位点数目的饱和点出现可以通过定义几个不同的阈值分析几个曲线到达平台期的数值来定义饱和的标准图中桔黄色线所示所指定的阈值即为最小饱和富集比率the minimum saturation enrichment ratioMSER所得到的最小饱和富集比率可以作为测序深度选择的参数。
当然一般的Human或者mouse的ChIP-seq数据选择20 million的数据就已经足够了。测序量不够一些比较弱的信号可能就会被噪音给盖住。 Q3 比对率达到多少是合格的
一般来说Illumina 测序的样品比例应该超过80%。不过也有例外像IgG这样的非dna结合蛋白的标记率通常较低(约60%)。当然这些数字也不是绝对的不是说80%可以79%就不成我们得根据实验设计来做具体判断。
80%以上的数据比对到了基因组上说明至少样本没有出问题。至于数据能不能用还得看peak calling步骤结果或者可以用IGV大致看看有没有信号。
Q4 如何理解覆盖度累积曲线中反映的信号富集程度
对样本比对结果reads累积情况进行展示。一定长度窗口(bin)上reads数进行计数然后排序再依次累加画图。input 在基因组上理论是均匀分布随着测序深度增加趋近于直线实验组在排序越高的窗口处reads累积速度越快说明这些区域富集的越特异。
narrow peak 富集程度高broad peak富集程度低。富集程度低不代表失败 如broad peak。但是如果是转录因子 富集程度低则需要谨慎对待。 Q5 什么样的igv可视化图可表征特异性片段富集 Q6 不同的组蛋白组结合区域有什么区别
虽然大多数ChIP-seq工具都是针对特定基因组区域的sharp peaks如转录起始位点TSS但一些组蛋白修饰与大基因组结构域相关从而导致富集区域广泛分布。H3K27me3和H3K36me3富集分布在几百个碱基上而H3K9me3 peaks通常扩展到几兆碱基。增强子标记H3K27ac和H3K4me1产生sharp peaks但有时也会构建broad富集区域称为“超级增强子”。H3K4me3启动子标记还可以覆盖小鼠卵母细胞中的broad结构域。这种peak形状和宽度变化影响最佳计算工具的选择。比如ROSE用于检测超级增强子位点Music用于计算要研究样本平均的peaks宽度。
Q7 不同的组蛋白call peak的区别是什么呢
对于不同组蛋白call peaks要根据在基因组结合的模式来判断是narrow 或者broad peaks然后再判断用何种方法去把相应的peaks 鉴定出来。在得到peaks list以后要随机在peaks list选取几个peaks拿到UCSC上去check一下看是否这些peaks足够准确。如不够sensitive则需要根据情况调整参数。
Q8 Call peaks的工具该如何选择
ChIP-seq技术经过多年的发展已经开发出了很多call peaks的工具例如FindPeaks、MACS、PeakSeq、SISSRs等等而且也都有大量发表的高水平文章引用这些工具常用的是MACS。然而需要注意的是对ChIP-seq数据进行call peaks分析需要具体问题具体分析这是由于不同的蛋白以及表观遗传学修饰在基因上分布的pattern是非常不一样的有H3K4me3那样非常sharp的peaks,也有H3K27me3那样非常broad的peaks。因此针对不同的ChIP-seq应该用不同的工具。一般针对于peaks比较sharp的ChIP-seq 数据用MACS14,而针对peaks比较 broad的ChIP-seq数据,用MACS2 callpeaks broad模式。
Q9 怎么知道结合的位置是broad还是sharp呢用igv看吗还是有什么评估的方法
主要先用IGV或者UCSC genome browser先看一下ChIP-seq的pattern更像哪一种patttern然后再决定使用哪种工具。
Q10 如何在ChIP-seq结果中寻找目标富集的Motif
有些蛋白是直接结合DNA此种情况下基于peak的motif预测结果查找是否有自己的目标蛋白
有些蛋白是与其它蛋白互作间接结合在DNA上此种情况下建议先查下自己的目标蛋白是否有互作蛋白然后再基于peak的motif预测结果查找motif list中是否有与自己的目标蛋白互作的蛋白。
