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摘要
植物高度和叶片角度是玉米Zea mays植物结构的两个关键决定因素与高种植密度下的抗倒伏性和冠层光合作用密切相关。这两个性状主要由几种植物激素调节。然而乙烯在调节玉米植物结构中的机制特别是植物高度和叶片角度尚不清楚。在此我们对一个玉米突变体Semidwarf3Sdw3进行了表征该突变体比野生型表现出更矮的植株和更大的叶片角度。组织学分析显示节间纵向细胞伸长的抑制和叶耳细胞伸长的促进是导致Sdw3突变体植株高度降低和叶片角度增大的主要原因。通过定位克隆我们鉴定出一个转座子插入到候选基因ZmACS7中该基因编码玉米乙烯生物合成中的1-氨基环丙烷-1-羧酸ACC合酶7。转座子改变了ZmACS7的C末端。转基因分析证实突变的ZmACS7基因赋予了Sdw3突变体的表型。酶活性和蛋白质降解实验表明Sdw3突变体中ZmACS7的改变的C末端增加了该蛋白的稳定性但不影响其催化活性。Sdw3突变体中的ACC和乙烯含量显著升高导致植株高度降低和叶片角度增加。此外我们还证明了ZmACS7在根发育、开花时间和叶片数量中发挥着重要作用表明ZmACS7是玉米生长和发育过程中一个具有多效性的重要基因。
材料与方法
植物材料
玉米Zea maysSdw3 突变体来源于田间的自发突变。选择杂合突变体 Sdw3/2 自交五代以生成近等基因系NILsN18野生型、Sdw3/2杂合突变体和 Sdw3纯合突变体。Sdw3 的近等基因系和转基因生成的株系包括 PC 株系、ZmACS7 OX 株系和 ZmACS2 OX 株系于 2015 年和 2017 年夏季在中国北京40.1°N, 116.2°E种植。转基因 pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 T0 植物在温室中种植。ZmACS7 KO 株系和转基因 L329’ 株系补充图 S6于 2019 年夏季在中国北京40.1°N, 116.2°E种植。
定位克隆
将 Sdw3 与自交系 P11、B73 和 Z58 进行杂交并将 F1 代回交其相应的野生型亲本以开发三个 BC1 群体。初步定位使用 86 个均匀覆盖整个玉米基因组的分子标记www.maizegdb.org。利用 96 个 P11 小群体目标基因最初定位在玉米第 10 染色体长臂的分子标记 p-bnlg1250 和 IDP8334 之间。开发了 10 个分子标记 M1 到 M10 进行精细定位如补充表 S1 所示。利用 1404 个 P11 大群体将 Sdw3 位点进一步定位在分子标记 M3 和 M10 之间。随后筛选了超过 10,000 个 Z58 和 B73 群体个体最终将 Sdw3 位点缩小到分子标记 M8 和 M9 之间的 8 kb 区间。
RNA提取和RT-qPCR分析
收集不同玉米品系在不同发育阶段的各种组织分别切成小块立即冷冻在液氮中并储存在-80°C。每个组织样本有三个独立的生物重复每个生物重复至少包含六株个体植物。使用植物RNA分离试剂盒www.huayueyang.com.cn/按照制造商的说明从样本中提取总RNA。使用FastKing RT试剂盒www.tiangen.com/将总RNA1微克逆转录。使用7500 Fast和7500实时PCR系统Applied Biosystems和SYBR Premix Ex Taq试剂盒www.takara.com.cn/进行RT-qPCR。ZmActin1GRMZM2G126010用于样本之间的标准化。RT-qPCR使用的引物列在补充表S1中。使用ΔΔCT方法测量目标基因的相对表达水平Livak和Schmittgen2001。所有数据基于三个独立的生物重复和四个技术重复。
系统发育分析和蛋白质序列比对
从Gramene数据库www.gramene.org获取五个注释的玉米ACS同工型和11个拟南芥Arabidopsis thalianaACS同工型的全长蛋白质序列AtACS3作为假基因被排除。这16个序列使用MEGA版本6.0中嵌入的ClustalW进行比对采用默认参数。使用邻接法neighbor-joining method和Poisson模型以及1000次自举重复构建系统发育树Tamura等2013。使用DNAMAN v6软件www.lynnon.com/中嵌入的多序列比对程序进行蛋白质序列比对。在某些情况下在自动比对后进行精细的手动调整以生成锚定比对以突出重要基序。
内源ACC和乙烯水平的定量
为了测量内源ACC分别收获在V7阶段的Sdw3和N18幼苗的从第7片叶子和第8片叶子之间发育中的节间、第8片叶子的叶鞘、以及第8片和第9片叶子的发育中的叶舌区域。每个样本从六株个体植物中收集并在液氮中粉碎。使用内标法每个样本约200毫克的新鲜植物组织用于提取内源ACC通过QTRAP 5500 LC-MS/MS系统AB SCIEXXin等2020测量。
内源乙烯水平的测量方法基于之前的描述稍作修改Habben等2014。在V7阶段收获N18和Sdw3幼苗的第七片和第八片叶片并使用打孔器制作小圆盘直径6.33毫米。圆盘在25°C下孵育2小时以使伤害引起的乙烯产生减少。每个样本的100个圆盘密封在带橡胶盖的20毫升顶空瓶中。孵育16小时后通过气相色谱法Shimadzu GC-17A测量瓶中的乙烯水平。最后将叶片圆盘干燥并称重以评估9个生物重复的标准化乙烯水平。
外源ACC和乙烯利处理
N18和Sdw3种子在10%v/vH2O2溶液中表面消毒30分钟用无菌水冲洗五次并在湿的滤纸上在28°C的黑暗中发芽36小时。发芽的种子在无菌蛭石中播种并在光照培养箱中培养1周相对湿度60%光照26°C14小时黑暗24°C10小时。手工去除幼苗的胚乳并将一片发育良好的叶子的均匀幼苗转移到装满完全浓度Hoagland溶液pH 6.0的18升不透光塑料箱中溶液中含有0.5 mM (NH4)2SO4、2mM Ca(NO3)2、0.25 mM KH2PO4、0.75 mM K2SO4、0.65 mM MgSO4、0.1 mM KCl、1 mM MnSO4、1 mM ZnSO4、0.1 mM CuSO4、0.005 mM (NH4)6Mo7O24、1mM H3BO3、0.1 mM FeSO4和0.1 mM EDTA-Na。将ACC或AVG的储备溶液加入塑料箱中并在Hoagland溶液中稀释至相应浓度0、1、10和100 mM ACC0和0.1 mM AVG。幼苗在人工气候室中培养3周相对湿度60%光照26°C14小时黑暗24°C10小时每3天更换一次培养液。第五片叶子完全发育后收获所有处理的株系进行形态观察和定量测量。由于玉米幼苗的高度主要由叶鞘长度决定测量了第五片叶鞘的长度和第五片叶的角度。
N18和Sdw3种子于2019年夏季在中国北京40.1°N, 116.2°E种植。从V7阶段开始每周喷洒N18植物的叶子各种浓度的乙烯利250、500和750 ppm每株植物20毫升直到雄穗出现。对照植物喷洒相同量的酸性双蒸水pH 5 2.5因为工作溶液中含有250、500和750 ppm乙烯利的pH值分别为2.79、2.56和2.42。在开花时测量植株高度、穗位高度、主穗上第二节间的长度和主穗上第一片叶子的角度。
质粒构建和植物转化
为了生成 pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 构建体从转基因受体 L329 的基因组中扩增出含有 2660 bp ZmACS7 推测天然启动子的 4172 bp DNA 片段以及从 Sdw3 突变体的互补 DNA 文库中扩增出的 1512 bp ZmACS7 编码序列并将其克隆到 pCAMBIA3300M 载体中。值得注意的是我们研究中使用的 ZmACS7 推测启动子已提交至国家生物技术信息中心 (NCBI) 的 GenBank 数据库。改变 CTD 和敲除 ZmACS7 的 CRISPR/Cas9 质粒按照之前描述的方法构建Xing 等2014。简而言之分别设计了两个位于 ZmACS7 转座子插入位点和翻译起始位点附近的特异性 19 bp Cas9 引导序列补充图 S7A 和 S15A使用 CRISPR-P (http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR) 并将其引入 pBUE411 载体。筛选并排除了转基因衍生的 PC 和 KO 突变体中的 Cas9 构建体引入序列。此外为构建过表达质粒 (Ubi:ZmACS7 和 Ubi:ZmACS2)将 B73 的 ZmACS7 和 ZmACS2 的完整编码序列融合到由玉米泛素启动子驱动的 pBCXUN 载体中来自中国农业大学作物功能基因组和分子育种中心 [CAU]。克隆使用的引物列在补充表 S1 中。pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 构建体、用于扰动 ZmACS7 (PC) 的 CTD 和敲除 ZmACS7 (KO) 的 CRISPR/Cas9 质粒以及过表达 ZmACS7 和 ZmACS2 (OX) 的 Ubi:ZmACS7 和 Ubi:ZmACS2 构建体被转化到 L329 中由 CAU 作物功能基因组和分子育种中心完成。pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 构建体也被引入转基因受体 B104 中。
重组蛋白的制备
从 N18 和 Sdw3 植物中提取的 ZmACS7 的整体编码序列以及分别表达 N18 和 Sdw3 的 ZmACS7 CTD 的截短 DNA 序列以及缺少 VHAS 基序的 CTD 独立地与 pColdTF 载体中的 HIS 标签序列融合www.takarabiomed.com.cn/。使用的引物列在补充表 S1 中。空载体和五个重组质粒随后被转化到大肠杆菌 BL21 菌株中以进行诱导表达。按照产品手册使用 ProteinIso Ni-IDA 树脂www.transgen.com.cn/纯化表达的蛋白质。使用增强 BCA 蛋白质测定试剂盒www.beyotime.com/测量纯化蛋白质的浓度。
ZmACS7特异性酶活性测定
特异性酶活性测定使用约8 pmol新纯化的HIS-ZmACS7N18和HIS-ZmACS7Sdw3融合蛋白在11.7毫升顶空瓶中进行反应瓶中含有0.5毫升反应缓冲液50 mM Tris-HCl4 mM二硫苏糖醇20 mM吡哆醛5-磷酸和150 mM SAM [pH 8.0]在30°C下反应30分钟。加100微升20 mM HgCl2终止反应后将样品在冰上预冷3分钟。加入100微升1:1v/v冷混合的商业NaClO10% [w/v]有效氯和饱和NaOH后立即用橡胶盖密封反应瓶并在冰上孵育3分钟孵育期间摇动一次。使用气相色谱法检测瓶顶空中的乙烯水平GC-17AShimadzuLuo等2014。
无细胞蛋白降解测定
无细胞蛋白降解测定按照Wang等2018b的描述进行并稍作修改。收获10天龄的野生型B73幼苗并在液氮中研磨成细粉。使用含有50 mM Tris-HCl0.5 M蔗糖1 mM MgCl210 mM EDTA5 mM二硫苏糖醇和1 mM ATP的降解缓冲液pH 8.0提取总蛋白。通过两次10分钟的离心12,000g4°C去除细胞碎片并通过MiraclothCalbiochem过滤上清液。收集提取物并补充50 mM MG132APExBIO或作为对照的二甲基亚砜。新纯化的HIS-CTDN18300 ngHIS-CTDSdw3308.5 ng和HIS-CTDDVHAS298.1 ng与HIS-CTDN18和HIS-CTDSdw3相同摩尔量蛋白与100微升总蛋白提取物约500微克总蛋白孵育。蛋白降解反应在25°C水浴中进行并在不同时间点加入SDS-PAGE装载缓冲液终止反应。使用抗HIS抗体通过免疫印迹分析检测HIS-CTD蛋白丰度并使用ImageJ软件imagej.nih.gov/ij/定量条带强度。
转录组分析
在V7阶段分别采集N18和Sdw3幼苗的第7片叶子和第8片叶子之间发育中的节间以及第8片叶子和第9片叶子的发育中的叶舌区域进行总RNA提取每个样本有三个生物重复。使用Illumina HiSeq mRNA构建方法进行文库构建并在Illumina HiSeq 4000平台上进行测序。RNA-seq数据分析按照之前描述的方法进行Trapnell等2012。简而言之在去除低质量碱基和接头序列后将干净的数据映射到玉米基因组AGPv3上使用TopHat v2.1.0ccb.jhu.edu/software/tophat/。RNA-seq数据标准化为每百万映射片段的每千碱基外显子片段数。使用Cufflinks软件包组装转录本比较并合并组装并识别差异表达基因DEGs。当将Sdw3与N18进行比较时使用表达水平变化超过两倍且假发现率q值小于0.05的标准筛选DEGs。从节间和叶舌区域的转录组中随机选择两个子集的15个DEGs通过RT-qPCR验证RNA-seq数据的可靠性。用于验证DEGs相对mRNA水平的RT-qPCR引物列在补充表S1中。
首先使用MapMan软件基于功能注释文件“Zm_B73_5b_FGS_cds_2012”https://mapman.gabipd.org对节间和叶舌区域的DEGs进行全球视图分析并从Gramene数据库www.gramene.org获取详细的基因注释。然后我们人工选择并分组分析与乙烯生物合成、信号传导和响应相关的基因决定细胞伸长的基因调节叶角的基因以及决定玉米开花时间的基因以分析DEGs的表达模式与表型变化之间的相关性。
